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Natur (2023)Diesen Artikel zitieren

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Netrin-1 ist bei Krebserkrankungen als protumoraler Mechanismus hochreguliert1. Hier beschreiben wir die Hochregulierung von Netrin-1 bei den meisten menschlichen Endometriumkarzinomen (ECs) und zeigen, dass die Netrin-1-Blockade unter Verwendung eines Anti-Netrin-1-Antikörpers (NP137) die Tumorprogression in einem EC-Mausmodell wirksam reduziert. Als nächstes untersuchten wir die Wirksamkeit von NP137 als erstklassigem Einzelwirkstoff in einer Phase-I-Studie mit 14 Patienten mit fortgeschrittener EC. Als bestes Ansprechen beobachteten wir 8 stabile Erkrankungen (8 von 14, 57,1 %) und 1 objektives Ansprechen gemäß RECIST v.1.1 (partielles Ansprechen, 1 von 14 (7,1 %), 51,16 % Reduktion der Zielläsionen nach 6 Wochen und länger bis zu 54,65 % Reduzierung in den folgenden 6 Monaten). Um den Wirkungsmechanismus von NP137 zu evaluieren, wurde ein Maustumor-Genprofil erstellt und wir beobachteten zusätzlich zur Zelltodinduktion, dass NP137 den Übergang vom Epithel zum Mesenchym (EMT) hemmte. Durch die Durchführung von Massen-RNA-Sequenzierung (RNA-seq), räumlicher Transkriptomik und Einzelzell-RNA-seq an gepaarten Biopsien vor und während der Behandlung von Patienten mit EC aus der NP137-Studie stellten wir eine Nettoreduzierung der Tumor-EMT fest. Dies war mit Veränderungen im Immuninfiltrat und verstärkten Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Tumormikroumgebung verbunden. Angesichts der Bedeutung der EMT bei der Resistenz gegen aktuelle Pflegestandards2 zeigen wir im EC-Mausmodell, dass eine Kombination von NP137 mit Carboplatin-Paclitaxel die Leistung von Carboplatin-Paclitaxel allein übertrifft. Unsere Ergebnisse identifizieren die Netrin-1-Blockade als eine klinische Strategie, die sowohl Tumordebulking als auch EMT-Hemmung auslöst und so möglicherweise die Resistenz gegen Standardbehandlungen lindert.

Netrin-1 ist ein embryonales, sezerniertes, mit Laminin verwandtes Glykoprotein, das eine Schlüsselrolle bei der neuronalen Navigation, Angiogenese und dem Zellüberleben spielt1,3,4. Es wurde gezeigt, dass Netrin-1, das hauptsächlich während der Embryonalentwicklung exprimiert wird, in einem großen Teil der menschlichen Neoplasien sowohl von Krebszellen als auch von der Tumormikroumgebung erneut exprimiert wird1,5. Insbesondere wurde gezeigt, dass dies bei entzündungsbedingtem Darmkrebs6,7, metastasiertem Brustkrebs8, Lungenkrebs9, Neuroblastomen10, Lymphomen11 und Melanomen12 auftritt. In präklinischen Modellen, die diese Krankheiten nachahmen, reichte die Interferenz zwischen Netrin-1 und seinen Rezeptoren aus, um den Tod von Krebszellen auszulösen und eine Hemmung des Tumorwachstums zu induzieren1,5,11,12. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde ein monoklonaler Antikörper (mAb), der Netrin-1 neutralisiert und die Netrin-1-UNC5B-Wechselwirkung blockiert, mit der Bezeichnung NP137 entwickelt13 und in einer Phase-1-Studie (NCT02977195) einer vorläufigen Sicherheits- und Wirksamkeitsbewertung bei Patienten mit fortgeschrittenen soliden Tumoren unterzogen ). Aufgrund einiger objektiver Reaktionen, die bei gynäkologischen Fällen während der Dosissteigerungsphase beobachtet wurden, wurde die Verlängerungsphase der Studie um Patienten mit Endometriumtumoren erweitert. Für die translationale Forschung wurde außerdem eine spezielle Kohorte mit obligatorischen Biopsien vor und nach der Behandlung eingerichtet. Vorläufige Daten aus dieser Studie wurden auf dem ESMO-Treffen 201914 bekannt gegeben, die Studie ist jedoch noch im Gange, wobei die Patienten weiterhin behandelt werden und die Ergebnisse nach der endgültigen Analyse vollständig veröffentlicht werden. In diesem Artikel berichten wir über translationale Daten, die parallel zur Phase-1-Studie bei Patienten mit Endometriumkrebs erstellt wurden, und stellen eine Reihe präklinischer und Biopsiedaten bereit, die zeigen, dass NP137 nicht nur die Tumorzellzahl reduziert, sondern auch eine Hemmung des Übergangs vom Epithel zum Mesenchym auslöst ( EMT)-Merkmale, die letztendlich die Tumorempfindlichkeit gegenüber einer Chemotherapie erhöhen.

Wir analysierten die Netrin-1-Expression durch quantitative PCR mit reverser Transkription (RT-qPCR) in einer Kohorte von 72 menschlichen Endometriumtumoren (Ergänzungstabelle 1a). Wie in der erweiterten Datenabbildung 1a gezeigt, ist Netrin-1 beim endometrialen Adenokarzinom (EC) deutlich hochreguliert, ohne dass sich die Grade oder Subtypen spezifisch ändern (erweiterte Datenabbildung 1b, c). Es wurde auch festgestellt, dass sein Hauptrezeptor, UNC5B, in Tumorgeweben stärker exprimiert wird als in normalem Endometrium (Extended Data Abb. 1a–c), während DCC, ein weiterer Netrin-1-Rezeptor, weder in normalem Endometrium noch in Endometriumkrebs exprimiert wird. Die Positivität von Netrin-1 (und UNC5B) wurde bei den meisten Endometriumtumoren durch Immunhistochemie (IHC) überwacht (Extended Data, Abb. 1d).

Wir gingen daher zu einem präklinischen Modell über, das die Entwicklung von EC rekapituliert, und verwendeten dabei das gentechnisch veränderte, zeitlich kontrollierte Pten f/f-deletierte Mausmodell (nämlich den Tamoxifen-induzierbaren CAG-CreERT+/−-Promotor), das nachweislich EC entwickelt in situ schnell, sowie Schilddrüsenhyperplasie15 (Abb. 1a). Daher behandelten wir Kontrollmäuse und Pten-deletierte Mäuse 3–4 Wochen lang mit NP137 (10 mg kg–1, dreimal pro Woche) und analysierten die Netrin-1-Expression und das Fortschreiten des Tumors. Wie in Abb. 1b, c gezeigt, wurde Netrin-1 in Maustumoren nach der Deletion von Pten hochreguliert, und diese Hochregulierung wurde nach der Behandlung mit NP137 verringert. Interessanterweise war NP137 mit einer verringerten Entwicklung von Endometriumtumoren (Extended Data Abb. 2a) und einem erhöhten Überleben (Abb. 1d) verbunden. Beachten Sie, dass es nach 7 Wochen nach der Pten-Deletion keine Verlängerung der Studie gab, da die meisten Mäuse Atembeschwerden oder andere Probleme aufwiesen Beschwerden aufgrund der Entstehung von Schilddrüsentumoren). Pathologen beobachteten nach der NP137-Behandlung eine verringerte Anzahl von Krebszellen (Abb. 1e) und ein gesünderes Endometriumgewebe (Abb. 1f). In ähnlicher Weise wurde eine Antitumoraktivität auch in der Schilddrüse von Mäusen beobachtet, die mit NP137 behandelt wurden (Extended Data Abb. 2b – e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Targeting von Netrin-1 in EC das Fortschreiten des Tumors hemmt.

a, Diagramm, das die experimentelle Strategie zeigt, die zur Induktion der Pten-Deletion in CAG-CreERT2+/−Pten f/f-Mäusen unter Verwendung von Tamoxifen-Injektion und entweder Behandlung mit NP137 oder Kontrolle verwendet wurde. Mäuse wurden eingeschläfert, wenn sie Atembeschwerden hatten15. b, Relative Messenger-RNA-Expression von Netrin-1, definiert durch RT-qPCR im Endometrium von CreERT2–/–-Tieren (n = 12) und in Tumoren, die nach Pten-Deletion (Tamoxifen-Injektion) in CreERT2+/– Pten f/f-Mäusen induziert wurden intraperitoneal mit NP137 (10 mg kg–1) behandelt (n = 12) und in der Kontrolle (n = 5). Balken sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Daten normalisiert auf das HPRT-Gen; Cp, Kreuzungspunkt. ***P < 0,001 CreERT2+/– gegenüber CreERT2–/– und #P = 0,0284 NP137 gegenüber der Kontrolle durch zweiseitigen Mann-Whitney-Test. c, Repräsentative Netrin-1-IHC-Analyse der EC in CreERT2+/− Pten f/f-Mäusen nach 6-wöchiger Tamoxifen-Injektion. Maßstabsbalken, 100 µm. d, Kaplan-Meier-Kurven, die das prozentuale Überleben für normale Mäuse (CreERT2–/–, rot, n = 8), mit NP137 behandelte Pten-deletierte Mäuse (grün, n = 14) und die Kontrolle (blau, n = 11) angeben. **P < 0,01 gemäß Mantel-Cox-Test. e, Quantifizierung von Endometriumläsionen durch Pathologen, dargestellt durch Tumorkomplexität (zunehmend dunklere Farbe von Hyperplasie über leichte, dann moderate intraepitheliale Endometriumneoplasie bis hin zu Adenokarzinom) zwischen Kontrollmäusen (n = 12) und denen, die mit NP137 mAb behandelt wurden (n = 16) . ***P < 0,001 gemäß Chi-Quadrat-Test und zweiseitigem exakten Fisher-Test. f, Repräsentative Bilder der H&E-Färbung der Gebärmutter von Mäusen, die in Woche 6 der Tamoxifen-Injektion getötet wurden, von Mäusen, die mit NP137 behandelt wurden, und von Mäusen der Kontrollgruppe. Maßstabsbalken, 50 µm.

Quelldaten

Basierend auf früheren Ergebnissen, die darauf hindeuten, dass die Netrin-1-Blockade eine praktikable Therapiestrategie bei Krebs ist, wurde ein Netrin-1-blockierender Antikörper für den klinischen Einsatz entwickelt13 und wird derzeit in Phase I/II evaluiert. Wir haben Wirksamkeitsdaten für 14 Patienten mit EC aus der laufenden Phase-1-Studie extrahiert (Ergänzungstabelle 1b,c). In dieser Studie wurde NP137 einmal alle 2 Wochen (Q2W) als Monotherapie bis zum klinischen/radiologischen Fortschreiten verabreicht. Wie in Abb. 2a und der erweiterten Datentabelle 1a gezeigt, wurde keine dosislimitierende Toxizität beobachtet und bei mehr als der Hälfte der Patienten (8 von 14) war die Krankheitskontrolle (stabile Erkrankung) die beste Reaktion (beste Gesamtreaktion, stabile Erkrankung). 57,1 %). Darüber hinaus zeigte eine 74-jährige Patientin mit fortgeschrittenem EC ein RECIST1.1-definiertes partielles Ansprechen (Patient Nr. 02-004; Ergänzungstabelle 1b). Die ursprüngliche Diagnose für diese Patientin ergab einen endometrioiden Ursprung, einen mikrosatellitenstabilen Phänotyp und die Expression von CK7-, PAX8- und Östrogenrezeptoren, jedoch keine Expression von CK20 oder Progesteronrezeptoren. Vor der Verabreichung von NP137 hatte sie mehrere Therapieversuche erhalten, darunter eine adjuvante Strahlentherapie und Carboplatin-Paclitaxel, gefolgt von Lurbinectedin als Erstbehandlung bei metastasierenden Erkrankungen und einen zweiten Versuch mit Carboplatin-Paclitaxel, doch trotz dieser Therapeutika kam es zu einem Fortschreiten der Lebermetastasen. Ein Positronenemissionstomographie-Computertomographie (PET-CT)-Scan, der bei der Aufnahme durchgeführt wurde, bestätigte eine intensive Aufnahme von Fluordesoxyglucose (vor C1D1). Sie erhielt 14 mg kg–1 intravenöses NP137 Q2W und unterzog sich nach 6 Wochen (d. h. nach Zyklus 3 von NP137) einer PET-CT-Untersuchung, die gemäß RECIST v.1.1 ein teilweises Ansprechen mit einer 51-prozentigen Reduzierung der Zielleberläsionen zeigte ( Abb. 2b, c und erweiterte Datentabelle 1b). Ein teilweises Ansprechen wurde im PET-CT-Scan nach 3 Monaten bestätigt (Abb. 2c) und dann noch einmal nach 6 Monaten, als die Größenreduktion der Zielläsionen 55 % erreichte (erweiterte Datentabelle 1b). Bei diesem Patienten kam es schließlich nach 17 NP137-Zyklen zu einem Fortschreiten der Krankheit und er erhielt anschließend eine zusätzliche Therapie, einschließlich Letrozol A, Immuntherapie und Tamoxifen, ohne dass es zu einem zusätzlichen objektiven Ansprechen kam.

a–c, Vierzehn Patienten (Durchschnittsalter 68,3 Jahre (44,7–80,6); ECOG-Leistungsstatus 0, n = 5; ECOG-Leistungsstatus 1, n = 9), die eine fortgeschrittene oder metastasierte EC im Stadium IV hatten und zuvor mit a behandelt wurden Der Median von drei (2,0–6,0) systemischen Behandlungslinien vor der Aufnahme wurde mit NP137 (14 mg kg–1, n = 11 Patienten oder 20 mg kg–1, n = 3 Patienten) mit einem Median von 5,5 Injektionen (2,0–17,0) behandelt ). a: Jeder Balken repräsentiert einen Patienten. Das beste Ansprechen auf die Behandlung wird auf der Grundlage einer Untersuchung durch den Prüfer (gemäß Protokoll) dargestellt. Ausgefüllte Sterne, radiologischer Verlauf gemäß RECIST v.1.1; Hohlsterne, klinischer Verlauf gemäß Einschätzung des Prüfarztes; rote Pfeilspitzen, teilweise Reaktion gemäß RECIST v.1.1; grüne Pfeilspitzen, stabile Erkrankung gemäß RECIST v.1.1; rote Kreise, Tod. b, Diagramm, das die Größenentwicklung der Zielläsionen (Summe von zwei Leberzielläsionen) von Patient Nr. 02-004 intravenös mit 14 mg kg–1 NP137 Q2W behandelt. Das Ansprechen des Tumors wurde als partielles Ansprechen (PR) nach 6 Wochen und dann nach 3, 6 und 9 Monaten bewertet; Eine Verringerung der Zielläsionsgröße um –30 % im Vergleich zum Ausgangswert weist auf eine teilweise Remission gemäß RECIST v.1.1 hin. Eine gepunktete Linie zeigt auch die 20-prozentige Vergrößerung der Zielläsionsgröße im Vergleich zum Nadir (minimale Läsionsgröße bei NP137-Behandlung). c, Transversale Scans des Abdomens mit Lebermetastasen zu Studienbeginn, C3D1 (nach Zyklus 3) und C6D1 (nach Zyklus 6) von Patient Nr. 02-004. Rote Pfeilspitzen zeigen interessierende Läsionen an.

Quelldaten

Um einen Einblick in die zugrunde liegenden Mechanismen zu erhalten, die die Netrin-1-Blockade mit der Hemmung des Tumorwachstums verbinden, haben wir zunächst anhand der hypothetischen Wirkungsweise der Netrin-1-Blockade analysiert, ob die Hemmung des Tumorwachstums mit dem Tod von Tumorzellen bei Pten-f/f-Tumoren verbunden ist mit NP137 behandelt. Wie in Abb. 3a, b gezeigt, erhöhte NP137 die Krebsapoptose, gemessen durch IHC bei aktiver Caspase-3. Als nächstes führten wir eine RNA-Seq von Pten f/f-Maustumoren durch, die mit NP137 im Vergleich zu unbehandelten Tumoren behandelt wurden. Unter den Signalwegen/Genen, die nach der Verabreichung von NP137 moduliert wurden, stellten wir nach der Behandlung einen Rückgang der EMT-bezogenen Gene fest. Mehrere In-vitro-Studien deuten auf eine Beteiligung von Netrin-1 an der EMT16,17,18,19 hin, die häufig mit dem PI3K/AKT-Signalweg verbunden ist, der bei Endometriumkarzinomen häufig verändert ist17,18. Anschließend untersuchten wir, ob NP137 die Tumor-EMT im Pten-f/f-Mausmodell beeinflussen könnte. Wir untersuchten zunächst die Expression des EpCAM-Epithelmarkers in der Kontrolle im Vergleich zu NP137-behandelten Tumoren und beobachteten einen statistisch signifikanten Anstieg dieses Epithelmarkers in NP137-behandelten Tumoren (Abb. 3c, d). Um einen allgemeineren Überblick über die Tumorgenexpression zu erhalten, verwendeten wir dann eine häufig verwendete EMT-Signatur für Bauchkrebs20, die zur Bestimmung des EMT-Scores20 verwendet werden kann. Wir beobachteten, dass die Behandlung mit NP137 den EMT-Score senkte (Abb. 3e), was mit einer verminderten Expression mesenchymaler Gene und einer erhöhten Expression epithelialer Gene einherging (Abb. 3f). Diese präklinischen Daten stützen die Ansicht, dass die Netrin-1-Blockade eine doppelte Wirkung auf Tumorzellen hat: Sie löst den Tod von Krebszellen aus und hemmt EMT-Funktionen, wodurch mit NP137 behandelte Tumoren insgesamt epithelialer werden.

a, Quantifizierung des Zelltods unter Verwendung von gespaltenem Caspase-3-IHC in Kontroll- (n = 8) und NP137- (n = 13) behandelten Tumoren von CreERT2+/−Pten f/f-Mäusen. Balken sind Mittelwerte ± Standardabweichung; *P = 0,0389 durch zweiseitigen Mann-Whitney-Test. b, Repräsentative Bilder der gespaltenen Caspase-3-Färbung von a. Maßstabsbalken, 100 µm. c, Relative mRNA-Expression des EpCAM-Epithelmarkers durch RT-qPCR in Maustumoren, Kontrolle (n = 5) und NP137 (n = 9). Balken sind Mittelwerte ± SEM, Daten normalisiert auf das HPRT-Gen; *P = 0,032 durch zweiseitigen Mann-Whitney-Test. d, Prozentsatz der EpCAM-hochexprimierenden Zellen in Kontrolltumoren (n = 4) im Vergleich zu mit NP137 behandelten Zellen (n = 7), ermittelt durch IHC. Balken sind Mittelwerte ± Standardabweichung; **P = 0,0061 durch zweiseitigen Mann-Whitney-Test. e, EMT-Score-Analyse (Mausorthologe der epithelialen (epith.) oder mesenchymalen (mes.) Signatur aus Lit. 20), abgeleitet aus RNA-seq-Daten, zwischen Kontrollmäusen (n = 3) und mit NP137 (n = 3) behandelten Mäusen . Balken sind Mittelwerte ± Standardabweichung; *P = 0,05 durch einseitigen Mann-Whitney-Test. f, aus RNA-seq-Daten abgeleitete Heatmap, die die Expression von EMT-Genen zeigt; Kontrolle (n = 3) und NP137 (n = 3). Beachten Sie, dass epitheliale Gene unter NP137-behandelten Bedingungen hochreguliert wurden, während mesenchymale Gene herunterreguliert wurden.

Quelldaten

Als nächstes stellten wir fest, ob die in den präklinischen Modellen beobachtete Hemmung der EMT-Merkmale auch bei mit NP137 behandelten Patienten auftritt. In der NP137-Phase-1-Studie wurden bei den oben beschriebenen Patienten mit EC gepaarte Biopsien zum Zeitpunkt der Aufnahme (C1D1) und nach einem Monat Behandlung mit der Anti-Netrin-1-Verbindung (d. h. kurz vor der dritten Infusion von NP137 (C3D1)) entnommen )). Bulk-RNA-Seq wurde erfolgreich an 12 gepaarten Biopsien vor und während der Behandlung durchgeführt (Ergänzungstabelle 1b), und wie in Abb. 4a, b gezeigt, erwiesen sich zwei Injektionen von NP137 als ausreichend, um einen signifikanten Rückgang des Pankrebs-EMT-Scores auszulösen oben beschrieben, was auf einen insgesamt stärker epithelialen Phänotyp des Tumors bei Patienten nach einmonatiger Behandlung mit NP137 hinweist. Die Verschiebung hin zu einem eher epithelialen Phänotyp wurde durch eine erhöhte EpCAM-IHC-Färbung in Tumorproben von mit NP137 behandelten Patienten bestätigt (Abb. 4c, d). Wir beobachteten auch einen Rückgang des Anteils der Tumorzellen, die Pancytokeratin und Vimentin koexprimieren (Abb. 4e).

a, Diagramm, das den EMT-Score zeigt, der mit Maks Signatur20 aus der RNA-Sequenz von Biopsien vor (C1D1) und nach zwei Zyklen der NP137-Behandlung (C3D1) (n = 12) berechnet wurde. Boxplots stellen den Mittelwert (25.–75.) dar, Whiskers reichen von Minimal- bis Maximalwerten und gepaarte Stichproben werden in der Einzelwertdarstellung identifiziert; *P = 0,0161 durch zweiseitigen t-Test. b, Schwimmerdiagramme, die die individuelle Entwicklung des EMT-Scores für jeden Patienten zeigen; ΔEMT ist der EMT-Score bei C3D1 minus dem bei C1D1; ΔEMT < 0 bedeutet Entwicklung hin zum epithelialen Phänotyp (grün) und > 0 hin zum mesenchymalen Phänotyp (rot). c, Prozentsatz der EpCAM-hochexprimierenden Zellen in C1D1- im Vergleich zu C3D1-Biopsieproben, wie durch IHC identifiziert; *P = 0,0313 durch zweiseitigen Wilcoxon-Test (n = 6 Patienten). Boxplots stellen den Mittelwert (25.–75.) dar, Whiskers reichen vom Minimal- bis zum Maximalwert und gepaarte Stichproben werden in der Einzelwertdarstellung identifiziert. d, Repräsentativer IHC von EpCAM in Tumoren in C1D1 und C3D1 für Patienten Nr. 01-030, 01-035 und 01-040. Maßstabsbalken, 50 µm. e, Repräsentative Bilder der Expression von Pancytokeratin (PanKRT) und Vimentin (VIM) (Kolokalisation von Pancytokeratin (grün) und Vimentin (rot) im zusammengeführten Bild, rechts) im primären endometrialen Adenokarzinom von Patient Nr. 01-040 vor und nach der NP137-Behandlung. Maßstabsbalken, 50 μm. Quantifizierungen wurden an den vollständigen Objektträgern durchgeführt und ähnliche Ergebnisse wurden für Patienten Nr. beobachtet. 01-030 und 01-034. f, Analyse des Tumorzellkompartiments bei Patienten Nr. 01-034 und 01-039 durch räumliche Visium-Genexpression. Violindiagramm des EMT UCell Normalized Enrichment Score (NES) aus histologisch ausgewähltem Visium-Spot zwischen Zellen der C1D1- und C3D1-Biopsie. ***P < 0,01 durch zweiseitigen Mann-Whitney-Test.

Quelldaten

Interessant ist, dass wir bei der Analyse der Veränderungen des EMT-Scores zwischen Biopsien zu Studienbeginn und während der Behandlung beobachteten, dass Proben von Patienten, bei denen das Fortschreiten der Erkrankung die beste Reaktion auf NP137 war (fortschreitende Erkrankung bei der ersten Bewertung nach 6 Wochen), keine Variation im EMT-Score zeigten. Im Gegensatz dazu gab es einen statistisch signifikanten Rückgang des EMT-Scores in Proben von Patienten, die die Krankheit unter Kontrolle hatten (mindestens stabile Krankheit nach 6 Wochen; erweiterte Daten, Abb. 3a).

Um formeller zu demonstrieren, dass die massive Veränderung des EMT-Scores, die bei der NP137-Behandlung bei Patienten beobachtet wurde, speziell in Krebszellen auftrat, verwendeten wir als ersten Ansatz das räumliche Genexpressionssystem 10x Visium, das mit formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Geweben kompatibel ist . Zwei Paare von C1D1/C3D1-FFPE-Schnitten von zwei Patienten mit EC wurden analysiert (Extended Data Abb. 3b, c) und ein räumliches Genexpressionsprofil wurde in vom Pathologen ausgewählten Regionen von Interesse durchgeführt, in denen nur Krebszellen durch Hämatoxylin und Eosin identifiziert werden konnten ( H&E)-Färbung. In beiden Fällen war der EMT-Score bei C3D1 im Vergleich zu C1D1 stark verringert (Abb. 4f). So zeigten bei Patienten nach einem Monat Behandlung mit NP137 die verbleibenden Krebszellen im Vergleich zu ihrem Status vor der Behandlung verminderte EMT-Merkmale.

Um diese Studien auf die Einzelzellebene auszuweiten, führten wir eine 3‘-Einzelzell-RNA-Seq (10x Genomics Next GEM 3‘-Kit) direkt an frischen Biopsien durch, die bei Einschluss (C1D1, 9.216 Zellen) in der NP137-Studie und nach einem Monat gewonnen wurden der Behandlung (C3D1, 7.159 Zellen) von einem Patienten mit fortgeschrittener EC (Patient Nr. 01-040; Ergänzungstabelle 1b und Abb. 5a). Unbeaufsichtigtes Clustering zeigte das Vorhandensein verschiedener Zellpopulationen, einschließlich Tumorzellen (die EpCAM, PGR und TFF3 exprimieren – alles Marker von ECs21), Immunzellen (gekennzeichnet durch die Expression von CD45 (PTPRC)) und krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs, markiert durch αSMA (ACTA2). )) und Endothelzellen (PECAM1-positiv) (Abb. 5b und erweiterte Daten Abb. 4a, b).

a, Abbildung von Patient Nr. 01-040 mit zwei Lungenmetastasenbiopsien – eine vor der Behandlung (C1D1) und eine nach zwei Zyklen der NP137-Behandlung (C3D1). b, UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection) von 16.375 Zellen aus zwei Lungenmetastasenbiopsien (links) oder vor der Behandlung mit 9.216 Zellen (C1D1, Mitte) und nach der Behandlung mit 7.159 Zellen (C3D1, rechts), gefärbt nach ihren vier Hauptzellen Zelltypen. c, Zusammensetzung der wichtigsten Zelltypen in C1D1- und C3D1-Biopsien. Links: Gesamtzahl der Zellen in jeder Bedingung; rechts, Anteil der Zellen in jeder Probe (beachten Sie, dass die Anzahl der Krebszellen nach der Behandlung deutlich abnahm). Farbkodierung wie in b. d, Violindiagramm des EMT-UCell-Anreicherungs-Scores zwischen Zellen der C1D1- und C3D1-Biopsie (zweiseitiger Wilcoxon-Test, P < 2,10–16). e, UMAP-Diagramm der subclusterierten Krebszellen aus dem gesamten integrierten Datensatz (C1D1 + C3D1). f, UMAP-Diagramm subclusterierter Krebszellen vor und nach der Behandlung. g, Zusammensetzung von Krebszellclustern in C1D1- und C3D1-Biopsien. Links, Zellennummern; rechts, Anteil der Zellen in jeder Probe (beachten Sie, dass die Anzahl der Krebszellen nach der Behandlung deutlich abnahm). h, Dichtediagramm des EMT-UCell-Anreicherungs-Scores, das Cluster 2/3 mit starker EMT-Anreicherung zeigt (beachten Sie, dass Cluster 2 nach der Behandlung abnahm (g, rechts)).

Die Behandlung mit NP137 führte zu einer statistisch signifikanten Verringerung des Tumorzellkompartiments (Abb. 5b, c und Extended Data Abb. 4b). Der Anteil der Tumorzellen nach einer Anti-Netrin-1-Behandlung war nach zwei NP137-Zyklen 3,19-mal niedriger (Extended Data Abb. 4b). Interessanterweise stellten wir zusätzlich zum Nettorückgang der Krebszellen einen statistisch signifikanten Rückgang des EMT-Scores im gesamten Tumorkompartiment fest, was auf einen insgesamt stärker epithelialen Phänotyp im Zusammenhang mit der NP137-Behandlung hinweist (Abb. 5d). Wir haben auch eine unvoreingenommene differenzielle Expressions- und Signalweganalyse nur in Tumorzellen durchgeführt (erweiterte Datentabelle 2). Bemerkenswerterweise war EMT der bedeutendste Begriff, mit einer Herunterregulierung nach Exposition gegenüber NP137 (erweiterte Datentabelle 2). Interessanterweise verringerten sich nach der NP137-Behandlung die meisten Unterkompartimente der Tumorzellen auf ähnliche Weise, und wir stellten fest, dass Tumorcluster 2, der die stärkste Abnahme aufwies, ebenfalls einen hohen EMT-Score aufwies (Abb. 5e – h; beachten Sie, dass sich Cluster bilden). 5–7 mit hohem EMT-Score waren nach der NP137-Behandlung nicht nachweisbar, wir können jedoch nicht ausschließen, dass sie nicht erfasst wurden, da diese Cluster bei C1D1 bereits sehr wenige Zellen aufwiesen.

Die im Tumorkompartiment auftretende Veränderung war auch mit einer Veränderung der Stromazellen verbunden (Abb. 5b, c und 6 und erweiterte Daten Abb. 4c – f, 5 und 6a). Bemerkenswert ist, dass die Behandlung mit NP137 offensichtlich einen Einfluss auf die Immunzellen zu haben schien (Abb. 6a, b und erweiterte Daten, Abb. 5a). Genauer gesagt stellten wir nach der NP137-Behandlung einen Anstieg der Lymphozyten mit zytotoxischen Funktionen fest (CD8+-T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK); Abb. 6c und erweiterte Daten Abb. 5b). Ein ähnlicher Anstieg der CD8+-Zellen wurde auch bei Pten f/f-Mäusen beobachtet, die mit NP137 behandelt wurden (Extended Data Abb. 5c,d). Interessanterweise haben wir nach der NP137-Behandlung beides in der Einzelzellanalyse von Patient Nr. festgestellt. 01-40 und in den räumlichen transkriptomischen Daten von Patienten Nr. 01-034 und 01-039 eine Zunahme sowohl der Anzahl als auch der Stärke der Interaktion zwischen T-Zellen und Tumorzellen (Abb. 6d, e). Insbesondere Einzelzell-RNA-seq-Daten zeigten einen Anstieg der Anzahl und Stärke der Wechselwirkungen zwischen CD8+ T-Zellen und Tumorzellen (Abb. 6d). Es wurde eine Abnahme der M2-Makrophagen festgestellt (Erweiterte Daten, Abb. 5e, f), zusammen mit einer Zunahme der Antigenpräsentation der Haupthistokompatibilitätsklasse I/II (Erweiterte Daten, Abb. 6a, b). Die Behandlung mit NP137 ist mit effizienteren Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) verbunden, da wir einen deutlichen Wechsel von Monozyten in C1D1 zu dendritischen Zellen in C3D1 beobachteten, die mit Krebszellen interagieren (Abb. 6d, e und erweiterte Daten Abb. 6b).

a, UMAP-Diagramme subclusterierter Immunzellen aus dem gesamten integrierten Datensatz (C1D1 + C3D1) für Patient Nr. 01-040, das die Zusammensetzung der wichtigsten Immunzellcluster in C1D1/C3D1-Biopsien (links) oder getrennt für C1D1 und C3D1 (rechts) veranschaulicht. b, Anzahl (links) und Anteil (rechts) der Immunzelltypen in jeder Probe. c, links, UMAP-Diagramm der subclusterierten Lymphozyten/NK-Zellen aus dem gesamten integrierten Datensatz (C1D1 und C3D1). T-regulatorische Zellen (Tregs) wurden gemäß den in Extended Data Abb. 5b gezeigten Markern bestimmt. Mitte, rechts, Zusammensetzung von T/NK-Zellclustern in C1D1- und C3D1-Biopsien; Zellzahl (Mitte) und Anteil der Zellen in jeder Probe (rechts). Beachten Sie, dass die Zahl der zytotoxischen CD8+-T-Zellen nach der Behandlung zunahm, während die der CD4+-Zellen abnahm. d, CellChat-Analyse des Einzelzell-Assays bei Patient Nr. 01-040, zeigt die unterschiedliche (C3D1/C1D1) Anzahl der Interaktionen (links) und Stärke der Interaktionen (rechts) zwischen Tumorzellen und Lymphozyten (oben) und zwischen Tumorzellen und APCs (unten). e, CellChat-Analyse des Visium-Assays bei Patienten Nr. 01-034 (oben) und 01-039 (unten) zeigen die unterschiedliche (C3D1/C1D1) Anzahl der Interaktionen (links) und die Stärke der Interaktionen (rechts) zwischen Tumorzellen und Stromazellen. Linienfarben zeigen höhere Zahlen oder stärkere Wechselwirkungen in C3D1 (rot) und C1D1 (blau) an. Die Segmentgröße ist proportional zum Unterschied in der Anzahl oder Stärke der Wechselwirkungen zwischen C3D1 und C1D1.

Aufgrund einer umfangreichen Literatur, die EMT als Hauptursache für Chemotherapieresistenz beschreibt2,22 und weil unsere Daten darauf hindeuten, dass die gezielte Gabe von Netrin-1 die EMT hemmt, haben wir untersucht, ob die Zugabe von NP137 zu Carboplatin-Paclitaxel (Carbotaxol), dem Standard- Eine therapiebegleitende Chemotherapie, die im klinischen Umfeld bei Endometriumkarzinomen eingesetzt wird, könnte die Wirksamkeit von Carbotaxol allein im Pten-f/f-Mausmodell des Endometriumadenokarzinoms verstärken. Wie in Extended Data Abb. 7 gezeigt, erwies sich die Behandlung mit NP137/Carbotaxol gegenüber Carbotaxol allein als überlegen und führte bei Mäusen zu vollständigen Reaktionen. Insgesamt zeigen diese präklinischen und klinischen Daten, dass ein Medikament im klinischen Stadium sowohl die Tumorzellverkleinerung induziert als auch eine allgemeine Hemmung der EMT-Funktionen auslöst, was die Möglichkeit bietet, Resistenzen gegen herkömmliche Therapien zu lindern.

Wir dokumentieren hier die klinische Aktivität der Netrin-1-Titration unter Verwendung von NP137 als Monotherapie. Während das Interesse an der Bekämpfung von Netrin-1 im Krebsbereich relativ neu ist13, weist dieser Bericht darauf hin, dass die gezielte Behandlung von Netrin-1 bei Endometriumkrebs wirksam sein könnte. Zusätzlich zur Generierung einer Reihe von Daten, einschließlich der Analyse einer menschlichen Kohorte und präklinischer Experimente an Mäusen, haben wir eine wichtige mechanistische Rolle von Netrin-1 bei der Resistenz und Progression von Endometriumkrebs bestätigt. Wir berichten auch über eine teilweise Reaktion, die bei einem Patienten mit EC festgestellt wurde, der einen Anti-Netrin-1-mAb erhielt. Diese teilweise Reaktion bei einem menschlichen Patienten unterstützt zusammen mit der Abnahme der Tumorzellzahlen bei Mäusen und der deutlichen Abnahme der Tumorzellen, die in der Einzelzell-RNA-seq-Analyse eines mit NP137 behandelten Patienten beobachtet wurde, die anfängliche Ansicht über die Wirkungsweise von der Netrin-1-mAb als Auslöser des Tumorzelltods1,23. Tatsächlich galt Netrin-1 früher als ein vom Embryonal sezerniertes Molekül, das bei Krebserkrankungen erneut exprimiert wird, um das Überleben von Tumorzellen zu fördern1,8. Es wird angenommen, dass NP137 durch die Blockierung von Netrin-1 die todesfördernde Aktivität des Netrin-1-Rezeptors freisetzt, wie in verschiedenen präklinischen Modellen beobachtet wurde11,12,13,24. Bei Patienten mit EC oder präklinischen EC-Modellen, die mit NP137 behandelt werden, wird erwartet, dass dies zu einer Abnahme der Tumorzellen führt.

Allerdings haben wir hier gezeigt, dass NP137 nicht nur den Tod von Tumorzellen induziert, sondern offenbar auch die EMT des Tumors beeinflusst. Nur wenige frühere Studien deuten darauf hin, dass Netrin-1 an der EMT beteiligt sein könnte, und diese zeigten nur In-vitro-Daten16,17,18,19, was eine wesentliche regulatorische Wirkung von Netrin-1 auf die EMT nur schwach unterstützt25. Tumor-EMT, bei dem Tumorzellen ihre epithelialen Eigenschaften verlieren und mesenchymale Merkmale annehmen, scheint ein wesentlicher Treiber der Tumorheterogenität zu sein und wurde mit verschiedenen Schritten der Tumorentstehung in Verbindung gebracht, wie z. B. Tumorinitiierung, -progression, Metastasierung und, in jüngerer Zeit, Resistenz gegen Chemotherapie oder Immuntherapie2. Während beim Verständnis der Rolle und Mechanismen, durch die EMT diese verschiedenen Tumorfunktionen reguliert, große Fortschritte erzielt wurden, gibt es immer noch praktisch keine pharmakologische Intervention, die es dem Kliniker ermöglicht, EMT bei Tumoren zu lindern. Man kann auch mit Fug und Recht behaupten, dass es bis heute keinen klinischen Beweis dafür gibt, dass EMT klinisch wichtig ist, da es keine Medikamente im klinischen Stadium gibt, die sich nur auf EMT-Merkmale auswirken. Hier zeigen wir anhand präklinischer Modelle und Biopsien von Patienten mit EC vor und während der Behandlung, dass die systemische Behandlung mit NP137 zu einer Verringerung der EMT-Merkmale des Tumors führte. Diese Hemmung der EMT-Merkmale ist mit einem insgesamt stärker epithelialen Phänotyp verbunden. Angesichts der extremen Komplexität der Tumorheterogenität haben wir noch nicht gezeigt, ob die Wirkung von N137 auf die Tumor-EMT durch eine direkte Wirkung der Netrin-1-Blockade auf Krebszellen vermittelt wird oder ob diese Wirkung auf eine indirekte Wirkung zurückzuführen ist, die durch Veränderungen in der Tumorzellen ausgelöst wird Tumor-Mikroumgebung. Es ist wahrscheinlich, dass diese Effekte kombiniert sind, da wir mithilfe der Einzelzellanalyse gezeigt haben, dass Änderungen der EMT-Merkmale mit Änderungen in der Tumormikroumgebung verbunden sind. Obwohl eine weitere Bestätigung erforderlich ist, beobachteten wir einen Rückgang der krebsassoziierten Fibroblasten, die normalerweise als Hauptquelle für EMT-induzierende Moleküle dienen26, und einen Rückgang protumorigener M2-ähnlicher Makrophagen, die ebenfalls über mehrere Mechanismen zur EMT beitragen27. Darüber hinaus beobachteten wir eine Zunahme der Lymphozyten mit zytotoxischen Funktionen und eine Zunahme sowohl der Anzahl als auch der Stärke der Interaktionen zwischen Immunzellen und Tumorzellen, die mit effizienteren APCs verbunden sind. Zusammengenommen stützt dies die Ansicht, dass NP137, möglicherweise durch Einfluss auf die EMT, die Immunantwort des Tumors verstärkt. Unabhängig vom Mechanismus spricht die Beobachtung, dass die Behandlung mit NP137 die Merkmale der Tumor-EMT hemmt, für die klinische Bewertung von Kombinationen des Anti-Netrins, da es immer mehr Literatur gibt, die EMT als Hauptakteur bei der Resistenz gegen Chemotherapie und Immun-Checkpoint-Inhibitoren beschreibt2,28 -1 mAb mit konventionellen Therapien, um das Fortschreiten des Tumors zu beeinträchtigen. Dies wird derzeit in der Phase-2-GYNET-Studie (NCT04652076) untersucht, in der die Sicherheit und Wirksamkeit der Kombination von NP137 mit Carboplatin-Paclitaxel und/oder Pembrolizumab (Anti-PD1-mAb) bei Patienten mit Endometrium- oder Gebärmutterhalskrebs untersucht wird.

Floxed homozygote Pten (C;129S4-Ptentm1Hwu/J, im Folgenden Pten f/f genannt) Cre:ER (B6.Cg-Tg(CAG-CRE/Esr1* 5Amc/J) Mäuse wurden vom Jackson Laboratory erhalten. Cre:ER+ /− Pten f/f-Mäuse wurden in einem gemischten Hintergrund (C57BL6; 129S4) durch Kreuzung von Pten f/f- und Cre:ER+/−-Mäusen gezüchtet. Um Mäuse zu erhalten, die sowohl Pten f/f-Allele (Pten f/f) als auch ein einzelnes Cre trugen :ER (Cre:ER+/−), Cre:ER+/− Pten f/+ Mäuse wurden mit Pten f/f Mäusen rückgekreuzt. Um die Deletion floxierter Allele zu induzieren, wurde Tamoxifen (Sigma-Aldrich) in 100 % Ethanol bei 100 gelöst 10 mg ml–1 Tamoxifen-Lösung wurde in Maisöl (Sigma-Aldrich) durch Vortexen emulgiert. Um die Pten-Deletion auszulösen, wurde erwachsenen Mäusen (4–5 Wochen alt) eine einzelne intraperitoneale Injektion von 0,5 mg verabreicht Tamoxifen-Emulsion (30–35 μg mg–1 Körpergewicht). Drei Wochen nach der Tamoxifen-Injektion wurden Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 µl NP137 oder seiner in PBS verdünnten isotypischen Kontrolle NP001 mit 10 mg kg–1 alle 2 Tage behandelt Die Pflege und Unterbringung der Tiere entsprach den institutionellen europäischen Richtlinien der lokalen Ethikkommission CEEA der Universität Lleida für Experimente mit Pten-Mäusen. Das allgemeine Verhalten und das Gewicht wurden dreimal pro Woche überwacht und die Tiere wurden im Falle einer starken Veränderung oder eines Gewichtsverlusts unter 20 % getötet. Alle Mäuse wurden immer vor dem Fortschreiten des terminalen Tumors getötet und das Endometriumgewebe wurde blind von einem Pathologen analysiert.

Endometriumproben, die im biomedizinischen Forschungsinstitut von Lérida (Spanien) gesammelt wurden, wurden eingefroren und in Trockeneis an das Krebsforschungszentrum von Lyon (Frankreich) geschickt. Die Proben wurden kryogemahlen, um Tumorpulver zu erhalten, das zur vollständigen RNA-Extraktion mit dem Nucleospin RNA Plus-Kit (Machery-Nagel) gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet wurde. Die Expression von mRNA wurde mit einem NanoDrop1000 (Themo Scientific) gemessen. Die RNA wurde mit dem T100 ThermoCycler (Bio-Rad) und dem iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers retrotranskribiert. RT-qPCR wurde mit LC480 qPCR (Roche) und OneGreen Fast qPCR Premix (Ozyme) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Patientenanalyse: Patienten-Mikrobiopsie-RNA wurde mit dem RNA easy FFPE Kit (Qiagen) extrahiert. Die RNA-seq-Bibliothek wurde aus 100 ng RNA mit dem Illumina TruSeq Exome Kit (RNA Library Prep for Enrichment & TruSeq RNA Enrichment) nach Herstellerangaben hergestellt und anschließend mit einem Illumina NovaSeq 6000 sequenziert. FASTQ-Dateien wurden anschließend mit STAR verarbeitet (v.2.7.10a). Kurz gesagt, FASTQ-Dateien wurden dem menschlichen Referenzgenom (gencode.v.27) zugeordnet und ausgerichtete Lesevorgänge wurden für die Zählung mit STAR konvertiert. Die Qualität der FASTQ-Dateien wurde ebenfalls von FATSQC (v.0.11.9) überprüft. Die RNA-seq-Analyse wurde mit R (v.4.0.3) und dem DESeq2-Paket (v.1.30.1) durchgeführt. Log2-transformierte Transkripte pro Million wurden berechnet, und wir führten die EMT-Score-Berechnung wie zuvor beschrieben durch20.

Modell für murinen Endometriumkrebs: Tumore wurden gesammelt, eingefroren und kryogemahlen. Die RNA wurde mit einem Standardkit (Macherey-Nagel) extrahiert. Die RNA-seq-Bibliothek wurde aus RNA mit Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Human/Mouse/Rat gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt und anschließend mit Illumina NOVASeq sequenziert. FASTQ-Dateien wurden wie oben beschrieben verarbeitet, mit Ausnahme des Referenzgenoms, das Mus_musculus.GRCm38 (GENECODE-Version 25) war. Die Analyse wurde mit den Paketen DESeq2 (v.1.30.1) und ggplot (v.3.1.3) in R (v.4.0.3) durchgeführt. EMT-Bewertungen und Heatmaps wurden mit log2-Fragmenten pro Kilobase-Exon pro Million zugeordneter Lesewerte durchgeführt.

Endometriummetastasenbiopsien wurden für die Einzelzell-RNA-Sequenz mit dem Tumor Dissociation Kit von Miltenyi Biotec (Nr. 130–095-929) dissoziiert. Kurz gesagt, die Biopsie wurde in RPMI-Medium in einer Petrischale auf Eis gelegt und nach Entfernung des nekrotischen Gewebes in kleine Stücke (2–4 mm) geschnitten. Anschließend wurden die Stücke mit der RPMI/Enzym-Mischung (Miltenyi Biotec) infundiert, in ein gentleMACS C-Röhrchen mit der RPMI/Enzym-Mischung überführt, an der Hülse des gentleMACS Octo Dissociator befestigt und mit dem Programm 37_h-TDK1 ausgeführt. Nach Abschluss des Programms wurden die Zellen 7 Minuten lang bei 4 °C und 300 g zentrifugiert, in RPMI resuspendiert, durch ein 70-μm-Sieb gegeben und die Zentrifugation wiederholt. Das Zellpellet wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 500 µl ACK-Lösung behandelt und die Lyse dann mit 5 ml RPMI/10 % FBS gestoppt. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in 100 µl RPMI resuspendiert. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde mit einem Luna-FL Dual-Fluoreszenzzellzähler (Logos Biosystems) bestimmt, um eine erwartete Zellwiederherstellungspopulation von 10.000 Zellen pro Kanal zu erhalten, auf einen 10x G-Chip geladen und auf dem Chromium Controller-System (10x Genomics) ausgeführt. nach Herstellerangaben. Einzelzell-RNA-Sequenzbibliotheken wurden mit dem Chromium Single Cell 3′ v.3.1-Kit (10x Genomics, Nr. PN-1000121) erstellt und auf der NovaSeq 6000-Plattform (Illumina) sequenziert, um etwa 50.000 Lesevorgänge pro Zelle zu erhalten.

Sofern nicht ausdrücklich erwähnt, wurden alle Analysen mit R/Bioconductor-Paketen, R v.4.2.2 (2022-11-10 r83330) (https://cran.r-project.org/; http://www.bioconductor) durchgeführt .org/) in einer Linux-Umgebung (x86_64-pc-linux-gnu (64-bit)).

Gefilterte Barcode-Matrizen aus Einzelzell-RNA-seq-Daten wurden mit dem Seurat-Paket (v.4.1.1) in R importiert. Dubletten wurden mit DoubletFinder (v.2.0.3) erkannt und herausgefiltert, zusammen mit Zellen, die eine geringe Anzahl von Merkmalen (nFeature_RNA < 500) oder einen hohen Prozentsatz an mitochondrialen Genen (über 25 %) aufwiesen. Seurat-Funktionen wurden zur Normalisierung (SCTransform), zum Zusammenführen, zur Dimensionsreduzierung und zum Clustering verwendet. Die anfängliche Identifizierung des Zelltyps basierte auf dem Konsens mehrerer automatisierter Zellannotationspakete (SciBet' v.1.0, SingleR v.1.10.0 und scType (https://github.com/IanevskiAleksandr/sc-type/blob/master/README). md)). T-Zell-Subtypen wurden visuell untersucht und nach weiterer Annotation mit ProjecTILs (v.3.0.3) und der Python-Implementierung von CellTypist (v.1.3.0) manuell kuratiert. EMT-Signatur-Scores wurden mit drei Methoden (AddModuleScore-Funktion von Seurat, UCell (v.2.2.0) und AUCell (v.1.18.1)) und unter Verwendung von zwei verschiedenen Genlisten (MsigDb Hallmark EMT-Pfad und PanCancer EMT-Signatur20) berechnet. Pathway-Anreicherungsanalysen wurden mit dem Paket „escape“ (v.1.6.0) durchgeführt. Zusätzliche Visualisierungen basierten auf Funktionen von Nebulosa (v.1.6.0), Scillus (v.0.5.0) und ggplot2 (v.3.3.6).

Räumliche RNA-seq-Matrizen und Bilder wurden mithilfe der Load10X_Spatial-Funktion des Seurat-Pakets in R importiert. Für jede Stichprobe wurden nur die Stellen mit mehr als 1.000 Merkmalen für die nachgelagerte Vorverarbeitung, einschließlich SCTransform-Normalisierung, Dimensionsreduzierung und Clustering, aufbewahrt. Die meisten Analysen wurden für jede Probe unabhängig durchgeführt (ohne Zusammenführung oder Integration). Für die Zelltyp-Annotation wurden zwei Strategien verwendet: Markierungstransfer nach Integration der oben beschriebenen Einzelzell-RNA-Seq-Daten und manuelle Annotation unter Verwendung bekannter Marker für wichtige Zelltypen.

Der Rückschluss auf die Zell-Zell-Kommunikation wurde mit CellChat (v.1.6.0) sowohl für Einzelzell- als auch für räumliche RNA-Seq-Daten durchgeführt.

Cre:ER+/− Pten f/f-Mäuse wurden nach 3-wöchiger NP137-Behandlung durch Zervixluxation eingeschläfert. Endometriumproben wurden gesammelt und über Nacht bei 4 ° C mit Formalin fixiert. Zur weiteren histologischen Analyse wurden die Tumoren in Paraffin eingebettet. Paraffinblöcke wurden auf 3 µm geschnitten und 1 Stunde lang bei 65 °C getrocknet, bevor die Vorbehandlungsverfahren der Entparaffinierung, Rehydratisierung und Epitopgewinnung im Vorbehandlungsmodul bei 95 °C für 20 Minuten in 50-fachem Tris/EDTA-Puffer durchgeführt wurden. Vor dem Färben der Schnitte wurde die endogene Peroxidase blockiert. Repräsentative Bilder wurden mit einem Leica DMD108-Mikroskop aufgenommen.

Die Immunhistochemie wurde mit einem automatisierten Immunfärbegerät (Ventana DiscoveryXT, Roche) unter Verwendung des Kaninchen-Omni-Map-DAB-Kits durchgeführt. Die Schnitte wurden mit spezifischen Antikörpern gegen EpCAM (Nr. ab71916, abcam), gespaltene Caspase-3 (Nr. 9661, Cell Signaling Technologies), Netrin-1 (Nr. CPA2389, Cohesion Biosciences) und Unc5B (Nr. 13851S, Cell Signaling) inkubiert Technologien) und CD8 (Nr. 4SM15, eBioscience). Die Färbung erfolgte durch Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase, sichtbar gemacht mit 3,3′-Diaminobenzidin als chromogenem Substrat und gegengefärbt mit Gill-Hämatoxylin. Histologische Quantifizierungen wurden mit Halo-Software (Indica Labs) durchgeführt.

Sequentielle chromogene Multiplex-IHC für Vimentin/Pancytokeratin (panCK), wie zuvor beschrieben, wurde an Tumorschnitten von Patienten durchgeführt, die in die klinische Studie NP137 einbezogen waren und die bei C1D1 und C3D1 gesammelt wurden. Entparaffinierte 4 μm dicke, in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte wurden zwei aufeinanderfolgenden IHC-Schritten auf einer Ventana Discovery XT-Plattform (Ventana, Roche Diagnostics) unter Verwendung der Erkennungssysteme REDMap und DABMap gemäß den Empfehlungen des Herstellers unterzogen. In einem ersten Schritt zur Vimentin-Expression wurden Objektträger 1 Stunde lang mit monoklonalem Maus-Anti-Human-Vimentin (Maus, Klon V9, Leica, Nr. NCL-L-VIM-V9, Verdünnung 1:100) und mit monoklonalem Kaninchen-Anti-Virus inkubiert -Maus-Sekundärantikörper für 20 Minuten (Klon M1gG51-4, abcam, Nr. 125913, Verdünnung 1:750). Die Objektträger wurden dann 24 Minuten lang mit biotinyliertem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper inkubiert (Vector Laboratories, Verdünnung 1:200), gefolgt von der Zugabe des Streptavidin-alkalische Phosphatase-Komplexes. Die Immunfärbung wurde durch Inkubation mit Naphthol und Fast Red nachgewiesen. Gewebeschnitte wurden mit Gill-Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert und montiert. Ganze histologische Objektträger wurden mit einem Hamamatsu 2.0 HT-Scanner bei 20-facher Vergrößerung digitalisiert. Nach dem Entfernen der Deckgläser wurden die Objektträger in 100 % Ethanol inkubiert, bis die rote Farbe vollständig verschwunden war. Um die panCK-Expression zu zeigen, wurden die Objektträger in einem zweiten Schritt 1 Stunde lang mit monoklonalem Maus-Anti-panCK-Antikörper (Maus, Klon CKAE1AE3, Dako Belgium, Nr. M351529-2, Verdünnung 1:150) und dann mit monoklonalem Kaninchen-Antikörper inkubiert -Maus-Sekundärantikörper für 20 Min. Die Objektträger wurden dann 28 Minuten lang mit biotinyliertem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper inkubiert (Vector Laboratories, Verdünnung 1:200), gefolgt von der Zugabe von Streptavidin-alkalischer Phosphatase. Die PanCK-Immunfärbung wurde durch Inkubation mit Naphthol und Fast Red nachgewiesen. Die IHC-Objektträger wurden mit Gill-Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert, montiert und erneut digitalisiert. Die Bildverarbeitung und Analyse für die Berechnung des Hynrid EMT-Scores wurden mit Visiomorph DP 2018.4 durchgeführt, um die Koexpression von Vimentin und panCK in jedem Gewebeobjektträger zu bestimmen. Kurz gesagt, jedes Paar mit Vimentin und panCK markierter virtueller Objektträger, die aus demselben Gewebeschnitt entnommen wurden, wurde einer Bildregistrierung unterzogen. Vimentin- und panCK-positive Bereiche wurden automatisch in den ausgerichteten virtuellen Objektträgern erkannt, um ihre Koexpression in Tumorzellen nachzuweisen. Diese Koexpression wurde auf ganzen Objektträgern bei 10-facher Vergrößerung ausgewertet, um mögliche Unvollkommenheiten zu berücksichtigen. Es wurden manuelle Korrekturen durchgeführt, um irrelevante Probenteile, wie z. B. Nekrose, auszuschließen. Zellkerne, die für beide Marker negativ waren, wurden ebenfalls ausgeschlossen, um sich nur auf zytoplasmatische Bereiche zu konzentrieren, in denen eine Kolokalisierung auftreten könnte.

FFPE-Gewebeschnitte wurden auf Visium-Objektträger gelegt und gemäß den 10x Genomics-Protokollen vorbereitet. Nach den Schritten H&E-Färbung, Bildgebung und Entkreuzung wurden Gewebeschnitte mit humanspezifischen Sonden inkubiert, die auf 17.943 Gene abzielten (10x Genomics, Visium Human Transcriptome Probe Set v.1.0). Auf mRNA hybridisierte Sonden wurden auf Visium-Objektträgern eingefangen und eine Genexpressionsbibliothek gemäß dem bereitgestellten Protokoll erstellt und auf einem Illumina NovaSeq 6000 mit einer angestrebten Sequenzierungstiefe von 50.000 Lesevorgängen pro Spot sequenziert.

Für jeden FFPE-Abschnitt wurden FASTQ-Dateien und Histologiebilder mit 10x Space Ranger v.2.0 verarbeitet, um die mit jedem Spot verknüpfte Genexpressionsmatrix zu erhalten.

Zur Durchführung der Analyse wurde Seurat v.4 (https://satijalab.org/seurat/) in R 4.1 verwendet. Kurz gesagt wurden gefilterte Matrizen geladen, pro Patient zusammengeführt und Spots mit weniger als 1.000 erkannten Genen entfernt. Nach der SCTransform-Normalisierung unterteilen wir den Tumorfleck entsprechend der Pathologen-Punktidentifikation und berechnen dann den EMT-Genset-Anreicherungs-Score (Escape-R-Paket) mit der UCell-Methode.

NP137 ist eine erste Phase-I-Studie am Menschen mit einem Teil zur Dosissteigerung, gefolgt von Erweiterungskohorten (NCT02977195), die an erwachsenen Patienten mit fortgeschrittenen oder metastasierten soliden Tumoren durchgeführt wird. Der Dosissteigerungsteil wurde durch eine beschleunigte Dosistitration mit einem Patienten pro Dosisstufe eingeleitet, bis ein arzneimittelbedingtes unerwünschtes Ereignis vom Grad 2 oder höher auftrat. Nach dem Auftreten eines NP137-bedingten unerwünschten Ereignisses vom Grad 2 wurden die Patienten in ein langsameres Dosissteigerungsdesign mit mindestens drei Patienten pro Dosisstufe aufgenommen, wobei eine modifizierte Methode der kontinuierlichen Neubewertung zum Einsatz kam. Zusätzliche Patienten wurden in drei Biomarker-Kohorten mit als sicher erklärten Dosierungen aufgenommen und aus pharmakodynamischen Gründen einer Paarbiopsie unterzogen. Im Dosissteigerungsteil wurden 19 Patienten in sieben Dosisstufen (1–20 mg kg–1, intravenös, Q2W) aufgenommen. Es wurden keine dosislimitierenden Toxizitäten beobachtet und bei 11 (58 %) Patienten traten infusionsbedingte Reaktionen mit Schweregrad 12 auf, alle bei Dosen von 4 mg kg–1 und mehr14. Basierend auf den verfügbaren Daten wurden 14 mg kg–1 Q2W als empfohlene Phase-2-Dosis ausgewählt. Es wurden zwei Erweiterungskohorten eröffnet, darunter eine für Patienten mit hormonrezeptorpositivem EC (Einschreibung im Oktober 2021 abgeschlossen).

Die Studie wurde gemäß den Richtlinien für gute klinische Praxis, der Deklaration von Helsinki und den relevanten französischen und europäischen Gesetzen und Richtlinien durchgeführt. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

Statistische Analysen wurden mit Prism (GraphPad-Software) durchgeführt. In den Legenden der Abbildungen bezeichnet n die Gesamtzahl der Replikate. Alle statistischen Tests waren zweiseitig. Bei Mausexperimenten wurden keine statistischen Methoden verwendet, um die erforderliche Probengröße vorab zu bestimmen, sondern die Probengröße wurde auf der Grundlage von Pilotexperimenten ausgewählt, bei denen geeignete statistische Tests angewendet wurden, die signifikante Ergebnisse liefern konnten. Die Überlebenskurven wurden mithilfe des Log-Rank-Tests (Mantel-Cox) analysiert. Die Bevölkerungsverhältnisse wurden durch Chi-Quadrat-Tests analysiert. qPCR-Expression, Caspase-3-IHC und Schilddrüsengewichte wurden mittels Mann-Whitney-Test verglichen. Für Daten von Patienten wurden Genexpressionen und EMT-Scores mittels T-Test verglichen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die rohen RNA-seq-, Einzelzell-RNA-seq- und räumlichen transkriptomischen Sequenzierungsdaten dieser Studie wurden im Gene Expression Omnibus mit der Zugangsnummer hinterlegt. GSE225691. Zur Versionskontrolle, Weitergabe und Reproduzierbarkeit wird der gesamte bioinformatische Code im Zusammenhang mit der Einzelzellanalyse in einem GitHub-Repository (https://github.com/hernandezvargash/NP137_single.cell) aufbewahrt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Mehlen, P., Delloye-Bourgeois, C. & Chédotal, A. Neuartige Rollen für Schlitze und Netrine: Hinweise zur Axonführung als Antikrebsziele? Nat. Rev. Cancer 11, 188–197 (2011).